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      基于結構的虛擬篩選、分子對接、動力學模擬和體外活性測定的方法發現一些新的利什曼原蟲γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制劑

      2018-03-16 14:33:27 來源:源資科技市場部

      新聞摘要:谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gcs)是一個重要的錐蟲甘肽合成酶。Gcs催化谷氨酸和半胱氨酸生成γ-谷氨酰半胱氨酸、ADP及無機磷。Gcs主要分布于真菌、錐蟲、杜氏利什曼蟲等體內。杜氏利什曼蟲會引起內臟利什曼蟲?。ɑ蚍Q黑熱?。?,致病性很強﹐患者如不治療﹐死亡率可達90%以上。因此發現一些新的Gcs抑制劑,用于治療利什曼蟲病非常重要。


      背景介紹:
            谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gcs)是一個重要的錐蟲甘肽合成酶。Gcs催化谷氨酸和半胱氨酸生成γ-谷氨酰半胱氨酸、ADP及無機磷。Gcs主要分布于真菌、錐蟲、杜氏利什曼蟲等體內。杜氏利什曼蟲會引起內臟利什曼蟲?。ɑ蚍Q黑熱?。?,致病性很強﹐患者如不治療﹐死亡率可達90%以上。因此發現一些新的Gcs抑制劑,用于治療利什曼蟲病非常重要。


      實驗過程:

       

      圖1 實驗過程

        因沒有利什曼蟲的谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gcs)的晶體結構,所以采用同源模建的方法,選擇同源性較高的釀酒酵母的Gcs(PDB_ID: 3LVV)作為模板進行對接研究。

        選擇Mabridge 數據庫的55000個化合物進行對接篩選。首先使用Suflex-Dock的標準模式進行對接,得到2041個化合物,然后使用超高精度模式Geomx進行對接,得到369個化合物。接著進行可視化分析,得到20個化合物??梢暬治龅臉藴蕿椋?、小分子與活性口袋互補;2、小分子可以和Phe179,Met322,Tyr397或Trp477形成疏水相互作用;3、小分子可以和Glu52,Glu55,Glu92,Glu99,Gln328,Tyr397,Lys483,Arg494或Arg498形成氫鍵。最后使用三種軟件對得到的20個分子進行重新對接,并選擇三個軟件對接打分都較高的5個化合物進行活性測定。


      實驗結果:
      1.篩選結果
        將篩選得到的5個化合物對接到谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gcs)的活性口袋,結果如下表1、圖2所示。它們和殘基Glu92、Asn324和Arg498之間存在極性相互作用,和殘基Phe179、Met322、Tyr397、Trp477之間存在疏水相互作用。值得注意的是,這些相互作用的氨基酸是保守的,同樣存在于錐蟲、酵母和人的谷氨酰半胱氨酸合成酶中。但是,氨基酸Glu52只存在于錐蟲中,在人和酵母中Glu52的位置處為Arg?;钚暂^好的抑制劑應該與這些氨基酸形成較強的相互作用,這些相互作用可以為新抑制劑分子的設計提供思路。

        從圖2A可知,所有配體都能和Arg498形成氫鍵相互作用。BTB13334和BTB13337還與Glu53、Glu92、Glu99、Gln328形成氫鍵作用。Glu99、Gln328與HTS05833、HTS01124形成氫鍵相互作用。所有配體的芳香環都與Phe179、Try397、Trp477、Met322形成疏水相互作用。

        這5個化合物的對接模式和已知抑制劑BSO的對接模式相似。圖2B為5個化合物的疊合結果,從圖中可以看出這5個化合物都有一個極性中心、一個疏水取代基和一個極性取代基。抑制劑BSO也有一個極性中心、一個疏水取代基和一個極性取代基。從疊合結果和對接結果可以得到這5個化合物可能比BSO的抑制活性要好,并且能較好的與活性口袋周圍氨基酸形成相互作用。

      表1 通過對接篩選得到的5個化合物及其相互作用的氨基酸

       


       

       

      圖2 (A)篩選得到的5個化合物在蛋白質活性口袋的相互作用圖;(B)5個化合物的疊合結果。


      2.動力學模擬結果
            使用Amber12軟件,對5個化合物與蛋白質的復合物進行10 ns的動力學模擬。從圖3A可以看出,蛋白質與配體BTB13334,BTB13337,HTS05833,HTS01124,HTS11169形成的復合物的RMSD值分別穩定在0.69,0.65,0.77,0.64和0.73 nm。復合物的RMSD變化較大可能是因為存在LOOP區的殘基。圖3B的RMSF值變化表明在波動較大的殘基200-300處為蛋白質的LOOP區。從圖3C動力學模擬過程中配體的RMSD值變化可以看出,經過10 ns的動力學模擬后5個配體達到穩定構象。從圖3D可以看出,5個配體都能與Glu92和Arg498形成氫鍵相互作用。BTB13334和Glu55之間有較強的氫鍵作用,BTB13337與Asn324、Arg373之間有較強的氫鍵作用,HTS11169與Glu55、Gln328、Arg373之間有較強的相互作用。

       

      圖3 動力學模擬結果。(A)復合物的RMSD值變化;(B)RMSF值變化;(C)配體的RMSD值變化;(D)配體與活性口袋周圍氨基酸的氫鍵占有率。


      3.活性測定
            實驗測定了5個化合物在濃度100和25 μM時對杜氏利什曼原蟲的抑制率。從圖4的抑制率結果圖可以看出,BTB13337在100 μM時抑制率達到60%,BTB13334、HTS05833、HTS11169在100 μM時的抑制率分別為34、36、20%?;衔顱TB1334、HTS05833、HTS11124在25 μM時抑制率大于25%。


      圖4 5個化合物對利什曼蟲的抑制活性


      結論:
            已知抑制劑BSO及其衍生物對哺乳動物的谷氨酰半胱氨酸合成酶的抑制活性較好,但缺少特異性,并且抑制劑BSO會對小鼠產生毒副作用。因此發展新的谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制劑非常重要。本研究使用分子對接、動力學模擬和生物活性測定等方法得到了5個新的谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制劑。這5個抑制劑對杜氏利什曼原蟲的抑制效果較好,并且對人產生的毒副作用較小。新發現的5個抑制劑結構相似,可以和活性口袋的Phe179、Tyr397、Trp477形成疏水相互作用。抑制劑分子與殘基Phe179、Tyr397和Trp477之間的疏水相互作用能增強其抑制活性,提高其特異性。新發現的5個抑制劑分子可以作為先導化合物設計出一系列新的谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制劑。


      參考文獻:
      Pragati  Agnihotri, Arjun K Mishra, Shikha Mishra, Vijay Kumar Sirohi, Amogh A. Sahasrabuddhe, J. Venkatesh Pratap. Identification of Novel Inhibitors of Leishmania donovani γ-Glutamylcysteine Synthetase using Structure Based Virtual Screening, Docking, Molecular Dynamics Simulation and In vitro Studies. J. Chem. Inf. Model. 2017, DOI: 10.1021/acs.jcim.6b00642.

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