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      IPA案例十二——網絡藥理學分析揭示抗內皮炎癥為丹紅注射液“腦心同治”的共同機制

      2017-12-06 17:38:29 來源:源資科技市場部

      新聞摘要:心腦血管疾病具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點,丹紅注射液對心腦血管的治療的作用機制尚不清楚。本案例采用IPA進行網絡藥理學分析,并進行實驗驗證,共同揭示丹紅注射液“腦心同治”的作用機制。


      摘要
      心腦血管疾病具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點,丹紅注射液對心腦血管的治療的作用機制尚不清楚。本案例采用IPA進行網絡藥理學分析,并進行實驗驗證,共同揭示丹紅注射液“腦心同治”的作用機制。


      背景
      心腦血管疾病具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點。隨著心腦血管疾病研究的深入,腦、心疾病之間的相關性研究得到越來越多的到關注。缺血性中風和冠心病是發病最多、最具典型的心腦血管疾病,其共同發病原因包括:炎癥、免疫、血栓形成、脂代謝和凋亡等,其中系統炎癥和免疫反應的作用尤為重要[1]。丹紅注射液主要由丹參、紅花組成,具有活血化瘀,通脈舒絡的功效。用于治療瘀血閉阻所致的胸痹及中風等病癥。在臨床上常用于治療缺血性中風和冠心病等疾病,但其共同的作用機制尚不清楚。本文采用網絡藥理學分析和實驗驗證相結合方法,來揭示丹紅注射液“腦心同治”的共同作用機制。

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      腦-心相關性[1]

      表1 丹紅注射液治療中風和冠心病的臨床調查

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      全文思路和流程

      ? 本研究主要分為四部分:建立數據庫;建立網絡;分析網絡;實驗驗證,如圖1。

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      圖1 研究思路和流程


      方法
      1,數據庫建立
      ????? 建立三個數據庫:通過整合(Ingenuity Pathway Analysis)IPA,OMIM,CADgene,NCBI-gene,GeneCards,MalaCards等數據庫獲得疾病相關的靶標;通過文獻挖掘及整合TCMSP,TCM Database@Taiwan,TCMID,TCMGeneDIT等數據庫得到中藥所含的化合物;通過整合IPA,TCMSP,TCMID等數據庫得到化合物對應的靶點。


      2,網絡建立和分析
      ????? 將上述建立的三個數據庫分別導入IPA中,建立“成分-靶標-疾病&功能-通路”網絡。通過核心分析,經典通路分析,功能分析,上游調控因子分析等功能進行數據的聚類和切入點的發現。


      3,實驗驗證
      ????? 通過基于高內涵的核轉位及Western blotting,ELISA等方法驗證分析結果。通過基于高內涵活性篩選的方法篩選活性化合物并驗證網絡分析的準確性。


      結果
      1,丹紅“腦心同治”共同靶標鑒定
      將建立的數據庫導入IPA進行可視化,共得到494個中風和371個冠心病相關靶標及149個共同靶標,如圖2A。丹紅中主要成分與這些靶標作用以后,共得到101個中風和162個冠心病相關靶標及68個共同靶標,如圖2B。

      圖2 丹紅治療中風和冠心病的共同靶標。(A)中風和冠心病靶標及共同靶標;(B)丹紅注射液可干預的中風和冠心病靶標及共同靶標。



      2,丹紅“腦心同治”的“成分-靶標-疾病&功能-通路”網絡建立及分析
      ????? 進而以丹紅“腦心同治”68個共同靶標為核心進行網絡的建立和分析?!俺煞?靶標”網絡展示了37個丹紅成分(其中丹參中20個,紅花中23個,共同成分6個)和68個靶標之間的作用關系,如圖3A;“靶標-疾病&功能-通路”網絡展示了68個靶標和排名前10的疾病,排名前10的功能,排名前20的通路之間的作用關系,如圖3B。根據-log(p-value)值對得到的疾病和功能進行相關性排序,排名第一的疾病為動脈粥樣硬化(atherosclerosis),如圖3C;排名第一的功能為炎癥反應(inflammatory response),如圖3D。進而我們根據疾病或功能將得到的通路分為6類并進行排序,如圖3E。排名第一的為動脈粥樣硬化通路(atherosclerosis signaling),如圖3F;排名第二的為HGMB1 signaling,如圖3G。

      ? 根據上述得到的結論,進而在丹紅“腦心同治”68個共同靶標中摘出50個與炎癥反應相關的分子,如圖4A;并進行上游調控因子分析,排名前20的上游調控因子,如表2?;?8個共同靶標,建立與炎癥反應和動脈粥樣硬化都相關的分子網絡,如圖4B。結合20個上游調控因子綜合分析,最終共得到6個核心分子,分別為三個炎癥因子:IL1B (IL-1β),TNF (TNF-α),IL10 (IL-10)和三個轉錄相關因子:RELA (NF-κB),JUN (c-jun),MAPK 14 (p38 MAPK),其相互作用關系,如圖4C。丹紅成分調控6個分子的網絡,如圖4D。

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      圖3 丹紅“腦心同治”網絡建立及分析。(A)成分-靶標網絡;(B)靶標-疾病&功能-通路網絡;(C)相關疾病排序;(D)相關功能排序;(E)相關通路排序;(F)atherosclerosis signaling(G)HGMB1 signaling。

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      圖4 丹紅作用于炎癥和動脈粥樣硬化相關的關鍵上游調控因子。(A)68個共同靶標中于炎癥反應相關的靶標;(B)68個共同靶標中與炎癥反應和動脈粥樣硬化都相關的靶標;(C)6個核心上游調控因子;(D)丹紅成分與6個核心上游調控因子的作用網絡。

      表2 上游調控因子分析

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      4,丹紅注射液逆轉脂多糖(LPS),氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),膽固醇晶體(CHC)誘導的c-Jun,p38 MAPK,NF-κB p65核轉位
      ????? 炎癥反應參與動脈粥樣硬化性心血管疾?。ˋSCVD)的始終,抗內皮炎癥是治療ASCVD的關鍵點?;谏鲜鼍W絡分析得到關鍵的3個轉錄相關因子,進而選用動脈粥樣硬化發生和發展過程中與炎癥反應相關的三個誘導劑LPS,ox-LDL,CHC誘導內皮細胞c-Jun,p38 MAPK,NF-κB p65的核轉位,并對比丹紅注射液干預后的效果。結果顯示,丹紅注射液能夠呈劑量依賴性的抑制LPS,ox-LDL誘導的c-Jun,p38 MAPK,NF-κB p65的核轉位,如圖5。

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      圖5 丹紅注射液在不同激動劑誘導的c-Jun,p38 MAPK,NF-κB p65的核轉位中的作用。(A和B)丹紅注射液在LPS誘導的c-Jun,p38 MAPK,NF-κB p65的核轉位中的作用;(C和D)丹紅注射液在ox-LDL誘導的c-Jun,p38 MAPK,NF-κB p65核轉位中的作用。(E)CHC誘導的c-Jun,p38 MAPK,NF-κB p65核轉位。


      5,丹紅注射液逆轉LPS,ox-LDL,CHC誘導的JNK, p38 MAPK, NF-κB p65磷酸化
      ????? 為了驗證丹紅注射液在核轉位中的抗炎作用,進而評價JNK, p38 MAPK, NF-κB p65在不同誘導劑LPS,ox-LDL,CHC刺激下的磷酸化水平。結果顯示,丹紅注射液能有呈劑量依賴性的抑制LPS,ox-LDL,CHC誘導的JNK, p38 MAPK, NF-κB p65蛋白磷酸化,如圖6。其結果與核轉位部分的結果基本一致。

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      圖6 丹紅注射液在不同激動劑誘導的JNK, p38 MAPK, NF-κB p65蛋白磷酸化中的作用。(A和D)丹紅注射液在LPS誘導JNK, p38 MAPK, NF-κB p65蛋白磷酸化中的作用;(B和E)丹紅注射液在ox-LDL誘導JNK, p38 MAPK, NF-κB p65蛋白磷酸化中的作用;(C和F)丹紅注射液在CHC誘導JNK, p38 MAPK, NF-κB p65蛋白磷酸化中的作用。



      6,丹紅注射液逆轉LPS,ox-LDL,CHC誘導的炎癥因子IL-1β,IL-10,TNF-α分泌
      ????? 基于上游調控因子分析,得到的三個關鍵炎癥相關分子:IL-1β,IL-10,TNF-α。仍選用LPS,ox-LDL,CHC來誘導其分泌,并驗證丹紅注射液對其作用。結果表明:丹紅注射液能夠不同程度的抑制LPS,ox-LDL,CHC誘導IL-1β分泌;丹紅注射液能夠不同程度的促進LPS,ox-LDL誘導IL-10分泌;丹紅注射液能夠不同程度的抑制LPS,ox-LDL,CHC誘導的TNF-β分泌,如圖7。

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      圖7 丹紅注射液在不同誘導劑誘導的炎癥因子IL-1β,IL-10,TNF-α分泌中的作用。(A-C)丹紅注射液在LPS,ox-LDL,CHC誘導IL-1β分泌中的作用;(D-F)丹紅注射液在LPS,ox-LDL,CHC誘導IL-10分泌中的作用;(G-I)丹紅注射液在LPS,ox-LDL,CHC誘導TNF-α分泌中的作用;


      7,丹紅注射液抗炎活性成分篩選
      為了進一步驗證網絡分析的準確性,采用基于高內涵的高通量活性篩選方法。選用LPS誘導的內皮細胞NF-κB p65(RELA)核轉位為模型,對以RELA為靶標的丹紅中14個成分進行篩選。最終共得到10個具有顯著抑制LPS誘導的RELA核轉位的活性成分,如圖8。同時也從一定程度上驗證了網絡分析的準確性。

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      圖8 丹紅抗內皮炎癥活性篩選。(A)丹紅中可作用于RELA分子的成分(B);丹紅中14個成分抗LPS誘導的RELA核轉位活性篩選;(C)以Apigenin(芹菜素)為實例的核轉位細節展示。


      結論
      丹紅注射液通過多分成,多靶點,多通路,多功能方式發揮“腦心同治”作用??箖绕ぱ装Y為丹紅注射液“腦心同治”的主要共同機制。本研究為今后丹紅注射液在臨床治療心腦血管疾病提供新的參考依據。


      參考文獻:
      1.?Chen, Z.; Venkat, P.; Seyfried, D.; Chopp, M.; Yan, T.; Chen, J. Brain-heart interaction: Cardiac complications after stroke. Circulation research 2017, 121, 451-468.


      原文:
      Lyu, M.; Yan, C.L.; Liu, H.X.; Wang, T.Y.; Shi, X.H.; Liu, J.P.; Orgah, J.; Fan, G.W.; Han, J.H.; Wang, X.Y., et al. Network pharmacology exploration reveals endothelial inflammation as a common mechanism for stroke and coronary artery disease treatment of danhong injection. Scientific reports 2017, 7, 15427.

      博士研究生呂明和嚴春琳為共同一作。朱彥教授為通訊作者,天津中醫藥大學為第一單位。


      致謝:
      本文為第一作者呂明撰寫,文章條理清晰,充分突出了IPA在進行分子網絡模擬中的作用,源資科技在此非常感謝作者對IPA軟件的支持,也歡迎各界IPA用戶投稿。

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