QIAGEN應用二：結合腫瘤基因組及轉錄組數據深度挖掘乳腺癌亞型分子網絡

2017-10-31 15:46:23　來源：源資科技市場部

前言：
      個性化醫療保健可以通過高通量的核酸測序來挖掘變異，并總結個人或組織中與發病率和致病的差異分子來實現。腫瘤相關的轉錄組學是一個非常復雜的系統，與蛋白質、藥物、代謝產物均相關的生物學過程。針對腫瘤基因組和轉錄組的數據挖掘，可以有效的篩選腫瘤生物標志物或治療靶點的變異。

  本案例以QIAGEN公司的IVA和IPA為工具針對腫瘤特異基因型和基因表達，挖掘腫瘤不同亞型的關鍵差異。針對乳腺癌的不同的亞型——快速轉移的乳腺癌亞型型（Claudin-low）和慢速轉移的乳腺癌亞型（luminal）進行測序并尋找與上皮細胞-間充質轉化（EMT）相關的變異分析。EMT是一個復雜的去分化過程，是胚胎早期發育的關鍵。而發生EMT的腫瘤細胞侵略性更強，能侵襲遠端的器官。

  多數Claudin-low亞型為三陰型（ESR1，PGR，ErbB2）乳腺癌，預后較差，也沒有有效的標志物；而luminal乳腺癌（包括A型與B型）預后良好。本案例主要挖掘導致EMT的關鍵因子，從兩種亞型中分別選取了5個具有代表性的細胞系，并對其RNA-seq數據進行深度挖掘。使用IVA進行變異分析尋找到僅在Claudin-low亞型中出現，發生錯義突變的HRAS基因。之后在IPA中再對其進行功能挖掘，發現在Claudin-low亞型中這一突變強烈的驅動了轉移前轉錄活動，并且HRAS受轉錄因子SNAl1和TWIST、EMT的生物標志物MMP2(matrix metalloproteinase-）調節.

材料和方法

 

IVA變異篩選結果：

  使用IVA可以根據不同條件設置，將獲得的387662條變異一層一層過濾。最終能找出具有生物學意義的突變。

 

 

  以上兩個過濾能夠將387662條變異，去除普通變異和遺傳變異，尋找和癌癥相關的EMT相關的變異，最后得出下圖，找到HRAS基因變異。

 

  得出HARS基因變異后，希望能對該基因進行網絡和功能的探索，尋找更深一步的生物學挖掘。

IPA生物功能挖掘

  IPA生成EMT相關基因網絡，按照基因功能（形狀）以及亞細胞定位作圖（如下圖）。而luminal乳腺癌與Claudin-low亞型乳腺癌對比的出基因的上下調，用紅色表示上調，綠色表示下調。圖中，紅圈表示公認的腫瘤標記物，MMP2（上調），CDH1與CLDN3（下調），藍色圓圈表示EMT關鍵轉錄因子（Snai1 / 2，Twist1，GSC，ZEB1/ 2）多數都是上調狀態。圖中實線表示與EMT相關的經典通路中參與的基因。

 

  下圖描繪與轉移相關基因網絡。圖中顯示出與HARS相關的基因連聯系。虛線紫色高亮顯示
      HRAS和MMP2的關系。圖中顏色表示luminal乳腺癌與Claudin-low亞型乳腺癌對比的出基因的上下調，用紅色表示上調，綠色表示下調?？梢奌ARS未有明顯的變化。

  在使用IPA時，可以認為的假定上調或下調某基因表達，預測與之聯系的基因的表達。如下圖所示，用IPA的MAP（分子活性預測）功能，假設上調HARS后，與之聯系的MMP2基因也會高表達，而CDH1基因則處于抑制狀態。而HARS上調，也對EMT相關的snail2，TWIST等基因有所影響。

 

  如果尋找在Claudin-low亞型乳腺癌中的上游調節因子。找到具有激活作用的相關轉錄因子，很容易能看到TWIST1，SNAI1 ，SPDEF等EMT中常見的轉錄調節因子。將其與其作用的基因共同做出下圖?？梢钥吹皆S多與EMT相關的生物過程中的關鍵分子比如上調了RHOA, SNAI2, ZEB1,ZEB2, HIF1A等，下調了CDH1,CLDN4, OCLN等基因。

 

  如果想看到上面的調節網路與HARS和CD44（多種腫瘤表面表達的糖蛋白受體）的關系，直接可用IPA的作圖功能加入這個網絡中，并創建與上面轉錄因子及其作用基因之間的關系，得出下圖。如圖可見：HARS收到上調影響，而圖中CD44卻收到一些下游影響。

 

  如果深究SNAI1與其他轉錄因子的機制網絡可以用IPA找到如下圖的關系?？梢钥吹絊NAI1對轉錄調節因子MMP2有強烈的上調作用，而對CDH1有下調的作用?？梢钥吹紿ARS在也存在于SNAI1主調節的網絡中，并且對MMP2和CDH1的活性均有影響。

 

案例總括：
      通過配合使用IVA和IPA，能夠解釋基因組（變異分析）和轉錄組（分子表達）數據。經對照分析luminal乳腺癌與Claudin-low亞型乳腺癌細胞系，找到HRAS變異，并確定出在Claudin-low亞型乳腺癌中，其參與了EMT的轉錄因子調控，并且找到一系列Claudin-low亞型乳腺癌相關的促轉移基因。

  IPA的預測計算功能能夠找尋到影響EMT的機制網絡以及關鍵的轉錄因子Twist1、Snai1 和MMP2因果網絡活性。

  在日常的分析中，很多基因產生成千上萬的Isoform和多種可能關系，變異分析與功能分析的雙重方法（IVA與IPA結合使用），能夠識別可能的因果影響和關鍵Isoform。

  每個預測的關系均有實驗得出的證據支持。IVA與IPA采用的均為有各領域專家人工整理的的數據庫，為所有與生物活動相關的預測結果提供準確的依據。